在威胁人类生命健康的各种因素中，恶性肿瘤作为主要因素，具有极高的死亡率。而对于恶性肿瘤来说，提高其生存率和治愈率的关键，在于早发现、早诊断、早治疗。
近年，癌基因检测试剂盒逐渐被应用于肿瘤检测中，通过对肿瘤标志物的检测，可极大改善肿瘤发病的早期诊断、治疗及预后。
图1：肿瘤；图片来源于网络，若有侵权联系删除
一什么是肿瘤标志物？
在医学上是这样解释的：肿瘤标志物(tumormarkers，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的，标志肿瘤存在和生长的一类物质。
实际上，人体正常细胞和癌细胞都会生成肿瘤标记物，它实质是一些糖类、脂类、肽类、激素等物质，只不过癌细胞的生成量远高于其他细胞。
随着时间推移，人们对肿瘤标志物认识也越来越完善，一些与肿瘤相关的基因，也被列入了肿瘤标志物的名单。
图2：肿瘤标志物检测阶段及肿瘤确诊诊断
衡量一个肿瘤标志物质量主要看它的敏感性和特异性，特异性可理解为“能不能对应某类肿瘤”，敏感性可简单理解为“能不能检测到肿瘤”。
图3：肿瘤细胞转移、侵染
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根据临床评价标准，肿瘤标志物应有以下几个特征：
（1）必须由恶性肿瘤细胞产生，并可在血液、组织液、分泌液或肿瘤组织中检测到；
（2）在正常组织或良性肿瘤含量较低；
（3）某一肿瘤的肿瘤标志物能在罹患该肿瘤的大多数患者中检测出来；
（4）临床上尚无明确肿瘤诊断之前就能检出；
（5）肿瘤标志物的量能反映肿瘤的大小；
（6）在一定程度上能有助于估计治疗效果、预测肿瘤的复发和转移。
二肿瘤标志物的敏感性和特异性
理论上，一个理想的肿瘤标志物检查的“敏感性”和“特异性”应该都为%，但很遗憾，业界至今没有发现一种具备高敏感性和特异性的标志物指标。这其中的主要原因就是，这些肿瘤标志物要么是特异性不高，要么是敏感性差，要么既没有多少特异性又没有多少敏感性，难以从肿瘤标志物的结果中得到你想要的结果。
图4：pixabay
1、特异性
所谓特异性，就是指某个指标，它在用于诊断或筛查某疾病时，不误诊的机会有多大。只要这个指标异常，就指向某个疾病，如果是%的特异性，就相当于是一对一的关系，有这个肿瘤标志物吗？没有。
2、敏感性
所谓敏感性，是指在全部肿瘤患者中的标记物阳性率。由于肿瘤有异质性（是指同一种肿瘤的癌肿瘤细胞间，或者同一种肿瘤的不相同的肿瘤患者，生物学上存在必定的差别性），通常来说鲜有肿瘤标记物敏感性为l00％。阳性率越高，就是敏感性越高，该肿瘤漏诊率就越低。
年发表在SciRep.的一篇研究，采集了30例Ⅰ~Ⅱ期和11例Ⅲ~Ⅳ期非小细胞肺癌患者的术前0~13天（平均3.9天）外周血、手术组织和术后2~10天（平均5.1天）外周血样本，使用CA50panel（包含了50个与肿瘤用药、致癌基因通路及肿瘤检测相关基因的个热点突变，通过IonTorrentProton检测平台、深度测序（10,x），对血浆ctDNA和组织tDNA突变情况进行了比较。
研究显示，检测到30例早期（Ⅰ-Ⅱ期）非小细胞肺癌患者血浆ctDNA的常见驱动突变，并且与组织tDNA高度一致，其中，一致性为80.0%，敏感性为75%，特异性90%，阳性预测值93.8%。
图5：肿瘤标志物一致性、敏感性、特异性研究结果展示
因此，作为当前肿瘤学研究的热点之一，肿瘤标志物还存在着明显的缺陷：
灵敏度和特异度不高，存在漏诊和误诊的可能；
检测费用高，联合诊断在普通查体中难以普及；
某些肿瘤的特异性标志物仍不明确，在临床中难以识别。
三如何增加肿瘤标志物分析灵敏度？
既然，肿瘤标志物灵敏度和特异性不高会影响肿瘤检测的结果，造成假阳性或假阴性。那么，如何增加肿瘤标志物分析灵敏度？
目前，液体活检(Liquidbiopsy)因不具备侵袭性，且可以在疾病治疗的不同阶段重复进行，使得目前肿瘤标志物检测的焦点从传统的生物物理检查、组织细胞学检查转向液体活检。
液体活检的检测方法，可以捕获到进入血液的其它细胞或DNA，从而替代了疾病的诊断，例如肿瘤。
液体活检包括CTCs、cfDNA/ctDNA、EVs、cfRNA、miRNA，最近比较火热的液体活检有：cfDNA、ctDNA和CTC的检测。
图6：液体活检分类
首先，cfDNA是什么？其实就是血液中游离的DNA片段。有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。
通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。基于cfDNA的液态活检中，ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛、研究最深入的分支。
但是cfDNA也面临着以下几个难题，导致肿瘤标志物分析灵敏度低：
图7：血液构成物质：细胞、EMV、DNA、RNA、蛋白质等
（1）正常血液提取DNA是全基因组DNA，包含良性细胞、白细胞和病毒的核酸，而肿瘤DNA似乎只占了一小部分。虽然对于肿瘤患者来说，异常坏死细胞会释放大量DNA进入血液循环导致cfDNA水平升高，但在cfDNA肿瘤早期筛查中仍然存在很多技术瓶颈。
（2）目前，cfDNA检验应用于临床常规的瓶颈主要集中于方法学和样本的质量上，由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，不同的采血方式以及DNA的降解是造成目前研究的主要障碍之一，表现在无法有效获取血液中微量的cfDNA，收集操作困难，丢失量大，检验灵敏度低。
（3）另外，抗凝剂使用和保存不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果。
其它因素：
DNA片段小；
半衰期短，30分钟之后稳定；
低含量/丰度：低nM/mL血清；
随着治疗效果的增加，肿瘤DNA比例大幅减少；
正常细胞DNA的污染。
那么，如何增加肿瘤标志物分析灵敏度？
（1）通过显著增加样本体积（即采集肿瘤患者更多的血液），来增加可检测分子的数量，但这种方法在晚期疾病患者中通常不具有临床可行性；
（2）通过大量血浆样本突变检测，确定被定义为肿瘤突变阳性所需的最小检测突变数，从而弥补ctDNA的低起始量。
（3）基于ctDNA/cfDNA的长度来富集ctDNA片段。近年来许多研究表明，ctDNA和cfDNA的片段长短存在差异，有研究报道它们比来自正常细胞的cfDNA约为bp，更短为~bp。
四凡知医学cfDNA提取试剂盒
实验简介：DNAladder掺入回收实验
凡知医学作为专业的提取试剂品牌，专门针对血浆游离提取片段进行了研究。在大量DNAladder掺入回收实验后，发现不同提取试剂盒对不同片段大小的提取敏感度存在明显差异。
Qsep片段分析示例：
凡知医疗试剂盒竞品试剂盒
实验结果分析
凡知试剂盒可良好回收不同片段大小的DNA，高分子量DNA回收率无明显降低。
使用自动化核酸提取仪的回收率更高；样本间一致性更好；样本量较多时可节约大量时间。
产品优势
产出率高：可最大程度上获取样本中的游离DNA；
纯度高：不含蛋白质、核酸酶等杂质，样本完整；
兼容性强：专为FireAuto32/96通道自动化核酸提取仪优化，良好兼容其它主流自动化核酸提取仪；
通量高：适配高通量自动化核酸提取仪，减少人工操作时间。
关于凡知医学
凡知医学(FireGenBiomedicals)是一家全球化运营的生物医药企业，由拥有世界顶尖药企30年从业资历的海归科学家团队创立，针对重大疾病搭建有先进的新一代核酸快速诊断试剂和仪器研发平台，创新实现了基因测序试剂盒、快速基因检测仪和检测芯片的开发，助推基因快速诊断进入基层医疗体系，致力于打造中国领先的基因快速诊断品牌，提供一体化诊断的仪器、芯片、诊断试剂和部分高端原料。